細胞轉(zhuan)染在科學研究中(zhong)扮演著(zhu)十分重要的角色，但也是最容(rong)易被忽略(lve)的一環。轉染(ran)效率的高低(di)不僅影響實(shi)驗結(jie)果，甚(shen)至可能導致得(de)到(dao)的實驗結果是無效的。在多(duo)種類型核酸(suan)的細(xi)胞轉染實驗中，研(yan)究者(zhe)們常需要進(jin)一步優化(hua)轉染(ran)條件以(yi)達到最優的轉染效(xiao)率，特別是(shi)較難轉染的細胞，而針對(dui)特定(ding)細胞類型選(xuan)擇對(dui)應專業化(hua)的轉染試劑只是(shi)邁(mai)向(xiang)轉(zhuan)染實(shi)驗(yan)成(cheng)功的第一步。

成立(li)于1995年(nian)的(de)Mirus Bio，專注及(ji)深耕核酸遞轉領域多年，從(cong)最早(zao)具有低毒性的(de)TransIT ? -LT1到(dao)GMP級別、可(ke)用于AAV和(he)LV生產的TransIT-VirusGEN? (產品年鑒(jian)請(qing)見(jian)圖1)。直至文稿發(fa)布時(shi)，使(shi)用Mirus產品(pin)發(fa)表(biao)文章已超過1萬篇，并且發表文(wen)章及Mirus數據庫涵蓋了超過(guo)1200種細(xi)胞類型。

圖1 Mirus產品年鑒

在細胞(bao)轉(zhuan)染實驗中，研究者們常常會忽略轉(zhuan)染(ran)效率/成(cheng)功率的評估，那么是否有對應(ying)技術或者方法允許(xu)實時監測(ce)DNA/RNA的(de)成功遞送以及細胞內(nei)的(de)分布狀態呢？Mirus Bio 為廣大(da)的科研工作者提供了一個方向。可對任何類(lei)型核酸，進行高效、直接的標(biao)記，并(bing)且為on-step的實驗操作。基于非酶反(fan)應的標(biao)記方法，在(zai)不損(sun)傷核酸完整性、不(bu)影響(xiang)基因表達的(de)前(qian)提下，將選擇(ze)的標(biao)記 (熒(ying)光、生物(wu)素(su)、地高辛等(deng))以共價的方(fang)式連接到核酸上。

Label IT? 試劑盒有(you)多種(zhong)標簽(qian)可供選擇，包括 Cy?3、Cy?5、CX-羅丹明、TM-羅丹明、熒光(guang)素、MFP488、地高辛、生物素和二硝基苯(ben)基(DNP)。也(ye)可用于基于(yu)胺的功能基團進行DNA或RNA修飾。產品特點如下：

• 可用于標記(ji)任何DNA或RNA模板——適用于(yu)多種應用 (In vitro & in vivo)，如(ru)Crispr基(ji)因編(bian)輯、核酸(suan)遞轉、RNA干擾/表(biao)達實驗、FISH、Microarray等；
• 一步法標記——簡單、輕松即(ji)可完成穩定(ding)的模版標記反應；
• 可根據(ju)實驗需求或應用，調節標記的(de)密度——以(yi)獲得(de)最佳(jia)檢測(ce)標記 DNA 或RNA 的靈敏度；
• 基于共價化學反應——對核酸殘基的(de)修飾為永久性(xing)、無損(sun)傷的，是多種科研應用的(de)理(li)想選擇(ze)。

絕大多數基于分子和生物學(xue)的In vitro 及 in vivo研究(jiu)都依賴(lai)于核酸的(de)標(biao)記或標(biao)簽(qian)，理想情況(kuang)下，此(ci)類(lei)標(biao)記或標(biao)簽(qian)不會影響核酸功能(neng)以及研究(jiu)結(jie)果。因此(ci)，也發展出來多種核酸標(biao)記方式，大致可(ke)以歸為以下兩類(lei)：

-????? 化(hua)學標(biao)記法：基(ji)于結(jie)合核酸(suan)的反(fan)應基(ji)團，比(bi)如Mirus 屬(shu)于(yu)此類，并且整(zheng)個反(fan)應(ying)過程并不需(xu)要酶的參與。

Label IT? 化學標記試劑(ji)由三個部分組成（如圖2）：

(1)????? 標簽/標記 (綠色區域)；

(2)????? Linker，與核(he)酸進行靜電(dian)相互作用 (黃(huang)色區域(yu))；

(3)????? Label IT? 試(shi)劑(ji)以共價形式連接(jie)到(dao)核酸中(zhong)活性雜原子的烷基化基(ji)團(藍色區(qu)域)。

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圖2. Label IT?標記分子示意圖

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-????? 基(ji)于酶(mei)反應標(biao)記法：通(tong)過酶促反(fan)(fan)應，在(zai)該(gai)反(fan)(fan)應過程中(zhong)加入標記(ji)修飾的(de)核酸(suan)。

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當待研(yan)究的核酸加入標記后，可(ke)通(tong)過以下兩種方式進行檢測(ce)：

-????? 直接檢測：這時，標記(ji)的(de)(de)核酸中包含了(le)可用于光(guang)學、發(fa)光(guang)或產生熒光(guang)信號(hao)的(de)(de)報告分子(zi)。

-????? 間接檢測(ce)：標記的(de)(de)核酸帶(dai)有標簽或標記，該標記需要特異(yi)性的(de)(de)結合(he)報告偶聯分子，如生物素結合帶有熒(ying)光標記的(de)鏈霉親(qin)和素，地高(gao)辛(xin)結合帶有(you)熒光標記的特異性(xing)抗體等。

• Label IT? 核(he)酸標記試劑盒——不改變核酸結構(gou)功能

基因沉默相關功(gong)能研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)在(zai)分子和細胞生(sheng)物學中發(fa)揮著重要作用，化學轉染也在(zai)該研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)領域扮演者重要角色(se)。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA)，常作為研(yan)究各種類型(xing)(xing)細胞中蛋白功能核酸類型(xing)(xing)，通過有效的knockdown從而影(ying)響基因表(biao)達(da)。那么，加入Label IT?標(biao)記的核(he)酸(suan)，是否會改(gai)變核(he)酸(suan)結構(gou)，從而影響到后續實驗結果呢？

評估測試(shi)使用，將(jiang)相同siRNA加入不同標記 (CyTM3, CyTM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒有標記siRNA，轉染后(hou)，可通(tong)過熒光(guang)顯(xian)微鏡觀(guan)察到帶有標記的siRNA。基(ji)因(yin)表(biao)達(da)結果顯示，帶(dai)有不同標記的siRNA，其(qi)目的基因表達水(shui)平近(jin)似，意味著(zhu)加(jia)入Label IT?標記的(de)核酸，并不影響目的(de)基因表(biao)達及功(gong)能 (圖3)。

圖3? Label?IT? siRNA Tracker? 試(shi)劑(ji)盒評估測試(shi)

• Label IT? 核酸標記試(shi)劑盒——前沿應用舉例

應用一：使用Label IT?技(ji)術，富集CRISPR'd細胞

Nasri 和 Mir 等人在文章中闡述了如何通過 Label IT? 技術(shu)，富集 CRISPR/Cas編輯(ji)成功的(de)細胞。基因組編輯(ji)實驗面臨最大的(de)挑(tiao)戰(zhan)之一是(shi)如(ru)何從未(wei)編輯(ji)的(de)細胞中成功的(de)篩選/富集出成功編(bian)輯的細(xi)胞(bao)，特別(bie)當未(wei)被編輯(ji)的細胞(bao)相對于成功編輯的細(xi)胞，具(ju)有生長/增(zeng)殖優勢，使(shi)得細胞篩選變得更加困難。

為了高效的區分經(jing)過基因編輯(ji)及未編輯(ji)的(de)細胞，作者在CRISPR引導RNA ( gRNA) 與 Cas9 形成(cheng)復(fu)合物及轉染細胞前，使用Label IT?對gRNA進行了(le)熒(ying)光標(biao)記，實驗(yan)流程(cheng)示意圖如下(xia)：

研究結果表明，使用Label IT?標記的gRNA 不會影(ying)響基因編輯效率，并(bing)且可通過(guo)熒光分選(xuan)/富(fu)集成功編輯的(de)細胞群。進一(yi)步地，研(yan)究者們將該 CRISPR 實(shi)驗流(liu)程應用于針對多種(zhong)細(xi)胞類(lei)型的GADD45B基因編輯(ji)實(shi)驗。根據(ju)細胞類(lei)型的不同，經過Label IT?標記的細胞亞群中，其成功編輯細胞占(zhan)比(bi)相對于總細胞群體提了(le)15-40%。

發(fa)表文(wen)章信(xin)息：

標題(ti):?Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者:?Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志:?Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI:?10.1182/bloodadvances.2017015511

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應(ying)用(yong)二：使(shi)用(yong)Label IT?技術，聚焦(jiao)于免(mian)疫系統研(yan)究

Label IT? 核(he)酸標記技(ji)術可(ke)用于(yu)一種新型疫苗(miao)注(zhu)射方法-微(wei)針(zhen)陣列(lie)(microneedle array, MNA)的(de)表征研究。傳統的(de)疫苗(miao)注射(she)方法是通過(guo) 3 厘米以上長度(du)的針(zhen)頭(tou)進行(xing)皮下注射，而(er)微針陣列則是由微米級針頭所組成(示(shi)意圖如下)，以(yi)無痛的方式細微的(de)的(de)穿透皮膚，進入到富含(han)免疫細胞群，可減少患者的(de)不(bu)適感。

為了提高疫苗的效力(efficacy)，通常會將免疫刺激分子(zi)或(huo) "激動劑(agonists) "與疫苗(miao)的靶標或抗原一同加(jia)入疫(yi)苗制劑中。Edwards 等人的研(yan)究表明，雙鏈 polyIC RNA 和單(dan)鏈 CpG DNA 寡核苷酸可作為(wei)微陣(zhen)列中的激動劑(agonists)。并且，研究者們(men)認(ren)為(wei)帶負電(dian)荷的核酸激動劑(ji)(agonists)和帶正(zheng)電(dian)荷(he)的抗原之間的靜電(dian)相(xiang)互作用，幫(bang)助了微陣列(lie)的組(zu)裝(zhuang)。通(tong)過使(shi)用 Label IT? Cy?3 和 Cy?5 ，分別針對以上兩種核酸(suan)(suan)類型進行熒光標記(ji)，方便(bian)用于查看標記(ji)核酸(suan)(suan)在微針(zhen)上(shang)的(de)分布，這(zhe)樣就允許(xu)了研究者(zhe)們按照(zhao)所需要的特定比例，將兩(liang)種(zhong)激動劑(ji)均一的(de)加入到(dao)微陣中，從而使得精(jing)確的調整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應成為可能。

發表文章信息：

標題:?Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者:?Camilla Edwards, Robert Oakes?et al.
雜志(zhi):?Nanoscale,?Volume 15, Apr 2023.
DOI:?10.1039/D3NR00333G

• Label IT? 核(he)酸標記試劑盒-產品選擇

Label?IT?試(shi)劑盒共有以下四(si)種形式可(ke)供選(xuan)擇，以應(ying)對(dui)研究(jiu)人員核酸標記實(shi)驗的(de)不同應用場景需求：

• Label?IT??Nucleic Acid Labeling Kits
• Label?IT?Tracker? Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
• Label?IT??siRNA Tracker? Intracellular Localization Kits
• Label?IT??Nucleic Acid Modifying Kits

下表總結了不(bu)同種類Label?IT?試劑盒區(qu)別：

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• 更多有關產品常(chang)疑問FAQ，請查看官網

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• Label IT? 核酸標(biao)記試劑(ji)盒-實驗優化之核酸(suan)標記密度

理想(xiang)的(de)密度取決(jue)于被標記(ji)的(de)核酸類(lei)型(xing)及下游應用。在需(xu)要直接追蹤核酸的(de)實驗中，更適合(he)較高的(de)核酸標記(ji)密度；而(er)在想要維持/完整的還原(yuan)標記核酸的(de)生(sheng)物學功能(neng)的實驗中，則(ze)更加適合較低(di)的標記密度。使用(yong) Label IT? 核酸標(biao)記(ji)技(ji)術，可以輕松調(diao)整到理想的標(biao)記(ji)密度。

Label IT? 試劑(ji)與核(he)酸的比例(v:w)的改變與標記(ji)密度(du)呈(cheng)線性相關性(圖 4)。例(li)如，按(an)照說(shuo)明(ming)的初次實驗建議，需加入 5 μl Label IT? 試劑(ji)標(biao)記 5 μg DNA，此時v:w比例為(wei)1:1。在保證孵(fu)育時(shi)間和 DNA 量不變的條件(jian)下，如將 Label IT? 試劑的(de)量(liang)降低為(wei) 2.5 μl 或 增加到10 μl，標記(ji)密度將分(fen)別降低一半(ban)或增加(jia)一倍。

實(shi)驗Tips：使用過高的 Label IT? 試劑量(liang)（超過建議量(liang)的 4 倍），可(ke)能會導致核酸(suan)裂解(jie)或引(yin)起(qi) Label IT? 熒(ying)光(guang)基團淬滅(mie)。

核酸標記密度(du)與(yu)所(suo)使(shi)用的 Label IT? 試劑量及(ji)反(fan)應的孵育(yu)時間(jian)呈(cheng)正線(xian)性相(xiang)關。可通過調整反應(ying)中 Label IT? 試劑的用量(liang)或反應的孵育時間 (孵育溫度仍為37℃)，可輕松靈活的調整到所需要的理想標記(ji)密度。

圖4. 核酸(suan)標記密度與Label IT?試劑用量和反應(ying)孵育時間成正比

實驗(yan)Tips：如何計算(suan)核酸(suan)標記密度，詳細實(shi)驗步驟及方(fang)法請見“。

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Mirus Bio公(gong)司(si)介紹(shao)

Mirus成立(li)于1995年，始終秉承著為基因遞轉提供最(zui)佳(jia)方法(fa)及最(zui)高效的工具。憑借(jie)超過 25 年轉染領(ling)域的深(shen)根細(xi)作，獲得了多項技術突(tu)破(po)，已成(cheng)為核(he)酸(suan)遞送領(ling)域的全球領(ling)導者和值得信賴的品牌。Mirus科(ke)學家(jia)團(tuan)隊不斷突破轉(zhuan)染(ran)技(ji)術(shu)的(de)極限(xian)，推(tui)出(chu)了VirusGEN?轉染試劑與RevIT?增強劑(ji)，進一步提(ti)升AAV/Lv產量，助力推動生(sheng)物治療藥物的(de)降本增效，為(wei)CGT領(ling)域客戶賦能。

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